FDA《对基因治疗用微生物载体（MVGT）的建议》
发布时间：2022-06-06
Recommendations for Microbial Vectors Used for Gene Therapy
对基因治疗用微生物载体（MVGT）的建议
FDA，2016
工程化活体生物药，属于工程化或转基因改造的传统益生菌、活体生物药LBPs（新一代益生菌NGP或非致病菌、人体共生菌），适用于预防、治疗人类疾病[1]。
关于工程细菌，目前可供参考的法规主要有美国FDA[2]、EMA[3]和CDE[4,5]，其中美国FDA于2016年发布了《对基因治疗用微生物载体（MVGT）的建议》（Recommendations for Microbial Vectors Used for Gene Therapy）行业指南，重点介绍了MVGT的IND申报中的CMC信息，并概述了此类产品的临床前和临床考虑因素，主要内容如下：
一、产品生产和特性
建议在IND申请中提供完整MVGT生产工艺的详细描述。还应说明MVGT产品生产过程中使用的所有组分，如微生物载体、微生物细胞库系统、微生物细胞共存的质粒/噬菌体、生产过程中使用的试剂以及任何辅料。此外，应说明生产过程中的所有流程。根据这些信息，FDA评估产品的同一性、质量、纯度和效力。
A. 产品制造—成分
1. MVGT种子库
应详细记录MVGT的历史描述，包括：a. MVGT克隆的选择（MVGT种子库应源自单个分离良好的菌落；应确保未将抗生素选择标记物（如β-内酰胺酶）引入MVGT；b.物理性能及生长特性；c.明确MVGT的基因构成；d.生长条件；e.基于Episomal/Plasmid的外源基因插入（如果含有质粒载体，应说明质粒导入亲代细胞所采用的方法）；f.染色体插入的外源基因（应描述插入方法）。
2. MVGT库系统
至少包括原始细胞库和工作细胞库。
a. 原始细胞库（MCB）
IND中应包括原始细胞库特性鉴定信息，包括安全性、同一性、纯度和稳定性检测等。对于50kb及以下的转基因质粒测序，应提供完整序列，并说明所有引入微生物的转基因质粒测序方法。
b. 工作细胞库（WCB）
特性鉴定所需的信息量通常少于记录原始细胞库特性鉴定所需的信息量。如果有两级细胞库，应对WCB进行以下检测：
•纯度
•有限的同一性检测（例如，PCR以检测是否存在缺失或插入）
•质粒检测（如含有天然或导入质粒的MVGT产品）
•抗生素敏感性特征
•活力
•细胞数量
•稳定性
3. 试剂
IND中列出产品生产过程中使用的所有试剂，试剂是细菌生长、选择、纯化或其他关键生产步骤必不可少的组分，但预期不是最终产品的一部分。
a.生产用试剂列表
对于MVGT生产中使用的每种试剂，应提交以下信息：
•试剂浓度
•使用该步骤的生产步骤
•供应商信息，包括产品识别号和批号
•试剂来源的信息（即是否为合成、重组或植物、动物或人源）
•试剂质量：建议尽可能使用FDA批准的产品或临床级试剂
b.确认生产中使用的试剂
应对试剂供应商提供的每批次COA进行审核。可能需要额外的检测以确保MVGT生产用试剂的安全性和质量。可制定一个确认计划，包括安全性检测（纯度、内毒素、支原体和外源因子）、功能分析和分析，以证明不存在潜在有害物质（如溶剂残留）。进行何种程度的检测取决于生产工艺中如何使用该试剂。
c.制剂中试剂去除的测定
应检测制剂中已知或具有潜在毒性的残留生产试剂。IND应说明用于检测最终产品中此类试剂残留的检测程序。FDA建议在启动临床试验之前确定研究是否足以记录去除情况，或者批放行检测是否适用。
d.其它问题
FDA建议不要使用抗生素进行细菌筛选。具体来讲，在人用治疗性产品的生产过程中不得使用β-内酰胺类抗生素（如青霉素）。如果使用了抗生素，建议您对最终产品中残留的抗生素量进行定量分析，并说明预防措施，以防止发生超敏反应。
B. 产品制造-程序
IND中应包含MVGT产品衍生、生产和纯化过程中使用的所有程序的详细描述。纳入生产和纯化工艺示意图以及过程中和最终产品检测，将有助于提供更明确的信息。
1. MVGT生产/纯化
应描述MVGT生产过程中使用的程序。包括：培养程序、细胞生长条件、细胞密度、细胞生长监测方法、收获条件等。
2. 灭活/杀灭细胞
如果最终产品是灭活/杀灭MVGT，则应说明细胞灭活/杀灭的方法和条件。IND资料中还应包括能够证明细菌复制能力不足、但在灭活后仍能保持其预期特征的数据。应通过无菌分析（包括生产MVGT产品所使用的培养基和生长条件）评价细胞杀灭情况。
3. 最终收获
应提供对最终收获物的详细描述，说明最终MVGT收获液是否在最终配制前进行了浓缩，如果是，应说明清洗条件和使用的缓冲液/培养基。如果MVGT在储存前进行了冻干，应说明冻干条件和用于冻干的稳定剂。
4. 最终配方
必须说明最终产品的配方，此外，IND还应说明辅料（如生长因子、缓冲液和盐稳定剂）是否纳入最终处方中，并说明其来源，还应确定这些辅料的供应商和最终浓度。
C. 产品检测
MVGT产品检测包括确保安全性的微生物检测以及产品特性评估，如鉴别、纯度（包括内毒素）、活性和效价。
1. MVGT产品的微生物纯度和无菌试验
2. 鉴别：对于菌种鉴定，建议采用至少两种互补方法分析
3. 纯度：纯度检测应作为种子储备液、MCB、WCB鉴定实验和制剂放行检测的一部分
4. 效价：效价检测应纳入MCB、鉴定和制剂放行中
5. 其它：活力、细胞数、聚合物检测
D. 原料药
原料药是预期提供药理学活性的活性成分。应对进一步加工（例如，热灭活、冻干、封装、制成片剂等）以获得最终DP的MVGT进行纯度、质粒（如适用）存在情况、活力、细胞数量等评估，IND中应包含这一信息，以及测试规范、验收限度和测试方法说明。
E. 药品
药品是用于患者给药的最终配制产品。应对所生产的各批次产品进行制剂放行检测。FDA建议使用表格格式来提供所有质量标准（如本指南第三部分C节中所描述的安全性、纯度、效价和同一性检测）。
F. 稳定性试验
应在IND的所有阶段进行稳定性试验，以证明产品在拟定临床研究的计划持续时间内处于可接受的化学和物理限度内。
应提交中控材料和最终MVGT产品的稳定性方案和数据。拟定的稳定性方案应包括对产品同一性、纯度、质量和效价的测定。对进行的每项检测，应说明检测方法、采样时间点（应有一个零时间点）、检测温度和其他适当信息，包括您对使用的指示产品稳定性的分析方法进行说明的理由，以及在临床方案要求的储存期间测量这些参数。
G. 额外测试
1. 抗生素敏感性试验
可能情况下，应对种子储备液、MCB和DP进行抗生素敏感性试验，试验结果纳入IND资料中。抗生素敏感性检测应包含至少两种一线治疗和两种二线治疗抗生素，通常用于治疗存在MVGT的微生物感染。
2. 容器/密封系统
应说明所使用的容器和封闭方式的类型，并确保容器和封闭方式与产品相兼容。
3. 残余含水量测试
如果使用冻干/干燥细菌产品，请参考FDA先前关于残留水分含量检测的建议。
4. 环境评价
在根据IND进行MVGT产品临床开发期间，您必须提交根据21 CFR 25.31的前瞻性排除声明或根据21 CFR 25.40的环境评估。
5. 生产工艺确认
MVGT产品的生产工艺需要使用复杂性、变异性和外源因子引入风险不同的试剂和原材料。应使用适当方法、设施和生产控制，以确保用于I期临床研究的MVGT生产符合适当的安全性、鉴别、质量和纯度标准。为II期和III期临床研究制造并根据BLA上市的MVGT产品必须符合21 CFR第210和211部分的要求。
二、临床前研究
在临床前研究中评价MVGT产品活性、安全性和生物分布的注意事项：
A. 动物种类及模型；
B. 安全性评价；
C. 衰减评价；
D. 生物分布/脱落：在许多临床试验中，MVGT产品不通过其自然感染或传播途径给药。因此，通过动物临床给药途径给药后MVGT和表达的转基因（如果适用）的生物分布/脱落特征是重要的安全性终点；
E. 抗生素使用：建议在存在和不存在各种抗生素的情况下评价MVGT产品的体内生物活性、安全性和生物分布/持久性特征，这些数据有助于指导选择有效的抗生素，以及在临床试验中适当的抗生素给药时间。
另外，为了生物安全，在工艺设计上，应符合以下要求[6]：
没有质粒和抗生素抗性基因：为了防止基因转移，工程益生菌应该没有移动的遗传元件，并且应该将遗传修饰（现有基因的过表达或新基因的引入）整合到益生菌的基因组中。这可能导致基因表达水平的降低，但是可以通过引入基因的多个拷贝或通过使用更强的启动子和核糖体结合位点来进一步提高水平。
遗传稳定性：在准备给予人之前，工程益生菌可以在补料分批生物反应器中生长，其中引入的遗传修饰可以随着益生菌生长至高密度而突变，导致治疗功效的丧失。这是非常可能的，特别是在遗传修饰对细胞产生高代谢负担并阻碍其生长的情况下。因此，为了提供遗传修饰的稳定性，可以通过使用诱导型或阻遏系统动态调节这些基因。在这两种情况下，当益生菌在生物反应器中生长时可以关闭基因的表达，但是当施用于人时可以打开表达。在生物反应器生长期间不存在表达的情况下，基因不会对细胞施加代谢负担，因此不太可能发生突变。目前，厌氧诱导型启动子已被用于调节大肠杆菌Nissle中酶的表达。
人体安全：此外，还应评估益生菌菌株在人体内的定植时间。虽然已知常用的益生菌菌株瞬时定位于胃肠道，但新型益生菌或减毒病原体可能是长期持续存在的，并且应该知道从胃肠道中消除它们的方法，例如通过使用特定抗生素，以防止过量和其他有害影响。
环境安全：从人体中消除后，工程益生菌将通过粪便释放到环境中。这些益生菌应缺乏环境中的增殖活性，以确保不会对天然动植物造成伤害。为了实现这一点，可以采用生物防护策略，包括仅在允许条件下遗传修饰益生菌以复制。这可以通过将合成营养缺陷型引入益生菌来实现。另一种生物防护方法是使用合成杀灭开关，益生菌响应来自环境的外部刺激而自杀。
参考文献：
[1] CHARBONNEAU M R, ISABELLA V M, LI N, et al. Developing a new class of engineered live bacterial therapeutics to treat human diseases [J]. Nature Communications, 2020, 11(1): 1-11.
[2] U.S. FDA. Recommendations for Microbial Vectors used for Gene Therapy [EB/OL]. 2016.
[3] European Medicines Agency. Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products [EB/OL]. 2018.
[4] CDE. 人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则[EB/OL]. 2008.
[5] 基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（征求意见稿）（中国，CDE，2020.09）
[6] AGGARWAL N, BREEDON A M E, DAVIS C M, et al. Engineering probiotics for therapeutic applications: recent examples and translational outlook [J]. Current Opinion in Biotechnology, 2020, 65: 171-9.